Г метод рекомбинантных плазмид. Рекомбинантная плазмида, штамм escherichia coli, химерный белок и их применение

Введение

Генетическая инженерия конкретнее и точнее клеточной по характеристике используемых объектов и оперирует в основном с разными по форме и размерам фрагментами клетки. Термиы «генетическая инженерия», «генная инженерия» и «рекомбинантная ДНК» - равноценны .

Генетическую инженерию можно представить как соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или их комбинацию in vitro с последующим введением полученных рекомбинантных структур в живую клетку для того, чтобы введенный фрагмент ДНК после включения его в хромосому либо реплицировался, либо автономно экспрессировался.

Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видеоспецифичность. Они нарабатываются как лекарственные средства путем микробтологического синтеза. При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет их совершенствовать: повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и так далее.

Основным при получении рекомбинантных белков является решение проблемы дефицита сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать их невозможно.

В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются: E.coli (кишечная палочка), Bacillus subtilis (сенная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи).

Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существует принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами.

Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровне и это относится к производству любых рекомбинантных белков.

1. Методы генной инженерии при получении рекомбинантных белков

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А.А.). По Э.С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний .

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

Конструирование рекомбинантной ДНК;

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – прежде всего ферментов рестрикции. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы .

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. Однако одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.

Одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.

2. Плазмиды. Понятие и типы плазмид

Наиболее распространённым методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных (содержащих чужеродный ген) плазмид, которые представляют собой кольцевые, двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов и способные к автономной репликации .

Для плазмид характерно стабильное существование в нехромосомном состоянии в бактериях. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5*106 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку - от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений.

Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими, то есть не проявляющимися в фенотипе клеток.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов.

Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмиды - это линейные или кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Большинство плазмид состоит из трех групп генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина. Отличительная особенность плазмид - способность к автономной репликации, поэтому минимальное количество ДНК, которое может быть названо плазмидой, - это фрагмент, обеспечивающий автономную репликацию плазмидной ДНК в клетке как единого целого.

Страница 1

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид.

Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (то есть размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественнного вектора» свойств:

Небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в E.coli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

Наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

Наличия одного или более селективных генетических мркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид.

Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь этот процесс называют клонированием.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42°С в течение 1,5 минут. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации -10-3, то есть на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки .

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличить трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы в ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Определение специфичности полученных антител
Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ г...

Соотношение категорий часть и элемент
Соотношение категорий часть и элемент весьма противоречиво. Содержание категории часть отличается от категории элемент: элементами являются все составные компоненты целого, независимо от того, выражается в них специфика целого или нет, а...

Дрожжи в современной биотехнологии
Дрожжи как источник белка Использование микробной биомассы для обогащения кормов белком и незаменимыми аминокислотами в условиях интенсивного животноводства - одна из важных проблем будущего, так как человечество развивается таким образо...

Получение рекомбинантной ДНК в искусственных условиях и клонирование генов впервые было осуществлено в 1972 г. американскими учёными Бойером и Коэном.

В этой молекулярной конструкции ДНК плазмиды выполняет векторную (направляющую) функцию, поскольку плазмиды могут рекомбинироваться в хромосомной ДНК. Эта векторная конструкция в силу наличия в ней гена устойчивости к антибиотикам была введена в бесплазмидную, т. е. неустойчивую к антибиотикам бактериальную клетку . Бактерии с рекомбинантными плазмидами в силу того, что они имеют ген устойчивости к антибиотикам, в отличие от бесплазмидных бактерий, не погибают в питательной среде , содержащей антибиотик. Поэтому в опытную пробирку вводится антибиотик и выделяется клон рекомбинантной бактерии, который затем выращивается. В каждой бактерии, составляющей данный клон, будет содержаться отрезок чужой (гетерологичной) ДНК, и этот отрезок может размножаться по мере размножения бактериальной биомассы . Кроме того, если реком-бинантная плазмида обладает способностью к автономной репликации, то отрезок чужой ДНК может размножаться ещё десятки раз. Размножение чужой ДНК посредством векторной конструкции называется клонированием генов. В качестве вектора при клони-ровании отрезков ДНК могут быть использованы вирусные и фаговые молекулы ДНК или

9384 0

Исследование молекул ДНК

Рекомбинантная ДНК содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Основные исследования выполнены на бактериях и вирусах, так как они являются одними из самых простых организмов, иначе их называют клетками «хозяина». Технология рекомбинантной ДНК позволяет получать генетические видоизмененные варианты целенаправленным и строго контролируемым путем.

Каким же образом гены высших организмов могут быть введены в бактериальные клетки? Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных ДНК, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5106 пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими, реплицирующими (т. е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные гены для бактерий, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат различные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они «входят» и «выходят» из бактерий, используется генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974 г. ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы.

Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактерии клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной (в первую очередь фаговой ДНК), что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности нуклеотидов в ДНК (так называемые сайты - участки узнавания) и вносят симметричные разрывы в цепях ДНК на равных растояниях от центра сайта. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированных ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», которые называются «липкими концами».

Из разных видов бактерий выделено около пятисот различных рестриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.

Методы генной инженерии

Весь процесс получения таких бактерий, называют клонированием. Он состоит из последовательных стадий (рис. 3.3):
1. Рестрикции - разрезания ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

Рис. 3.3. Введение гена в плазмиду Escherichia coli и клонирование этого гена в клетках кишечной палочки
Плазмида E.coli расщепляется рестрикционной эндонуклеазой в специфическом участке в обеих цепях ДНК, так что на концах расщепленной плазмиды располагаются короткие неспаренные последовательности дезоксирибонуклеотидов (ТТАА или ААТТ), т. е. по четыре нуклеотида, в которых основания представлены тимином и аденином.
Ген, который нужно встроить в плазмиду, выщепляют с помощью этой же рестриктазы, так что его концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды (ААТТ и ТТАА).
Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают вместе с помощью лигазы. Затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку Е.соН,которая, размножаясь, образует клон, все клетки которог содержат рекомбинантную плазмиду, а поэтому и чужеродный ген. Последний теперь клонирован в клетках кишечной палочки и индуцирует в ней синтез специфическогобелка.

3. Трансформации - введения рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плаз-миды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Их разделяют, используя определенную питательную среду (например, раствор антибиотика). Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининга - отбора среди клонов трансформированных бактерий тех, которые сохраняют плазмиды, несущие ген человека.

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей или не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена.

Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, которая является транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) - синтезируют комплементарную цепь ДНК, после чего и-РНК, служащая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой (ДНК-полимераза) комплементарной второй цепи ДНК.

Получаемая двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК), она соответствует гену, с которого была считана и-РНК. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которая трансформирует бактерии, и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, то естьсодержащих чужеродный ген, плазмид.

Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может содержать несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.

Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (то есть размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественнного вектора» свойств:

Небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в E.coli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

Наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

Наличия одного или более селективных генетических мркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид.

Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию E. coli. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь этот процесс называют клонированием.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42°С в течение 1,5 минут. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации -10 -3 , то есть на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки .

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличить трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы в ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется E.coli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность E.coli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E.coli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов - полиленкер.

Эффективными методами трансформации E.coli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Главная » База знаний » Г метод рекомбинантных плазмид. Рекомбинантная плазмида, штамм escherichia coli, химерный белок и их применение